Zirkulierende exosomale mRNA-Signaturen für die Frühdiagnose von klarzelligem Nierenzellkarzinom

BMC Medicine Band 20, Artikelnummer: 270 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Für die Frühdiagnose des klarzelligen Nierenzellkarzinoms (ccRCC) gibt es bisher keine nachgewiesenen Tumorbiomarker. Ziel dieser Studie war es, neue Biomarker für ccRCC auf der Grundlage exosomaler mRNA (emRNA)-Profilierung zu identifizieren und emRNA-basierte Signaturen für die Früherkennung von ccRCC zu entwickeln.

Es wurden 488 Teilnehmer rekrutiert, darunter 226 lokalisierte ccRCCs, 73 Patienten mit gutartigen Nierentumoren und 189 gesunde Kontrollpersonen. In der Entdeckungsphase wurde eine zirkulierende emRNA-Sequenzierung in 12 ccRCCs und 22 gesunden Kontrollpersonen durchgeführt. Die Kandidaten-emRNAs wurden mit 108 ccRCCs und 70 gesunden Kontrollpersonen in der Test- und Trainingsphase bewertet. Die emRNA-basierten Signaturen wurden durch logistische Regressionsanalyse entwickelt und mit zusätzlichen Kohorten von 106 ccRCCs, 97 gesunden Kontrollpersonen und 73 gutartigen Personen validiert.

Fünf emRNAs, CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 und SETD2, wurden als neue potenzielle Biomarker für ccRCC identifiziert. Wir haben eine frühe diagnostische Signatur weiterentwickelt, die KMT2D und PREX2 umfasste, sowie eine differenzielle diagnostische Signatur, die CUL9, KMT2D und PREX2 für die RCC-Erkennung umfasste. Die frühe diagnostische Signatur zeigte eine hohe Genauigkeit bei der Unterscheidung von ccRCCs von gesunden Kontrollpersonen, mit Flächen unter der Receiver Operating Characteristic Curve (AUCs) von 0,836 bzw. 0,830 in der Trainings- und Validierungskohorte. Die differenzialdiagnostische Signatur zeigte auch eine hervorragende Leistung bei der Unterscheidung von ccRCCs von gutartigen renalen Raumforderungen (AUC = 0,816), einschließlich solider Raumforderungen (AUC = 0,810) und zystischer Raumforderungen (AUC = 0,832).

Wir haben neuartige emRNA-basierte Signaturen für die Früherkennung von ccRCC und die Differentialdiagnose unsicherer Nierentumoren etabliert und validiert. Diese Signaturen könnten vielversprechende und nichtinvasive Biomarker für die Erkennung von ccRCC sein und so die Prognose von ccRCC-Patienten verbessern.

1. Die Sequenzierung zirkulierender exosomaler RNA identifizierte neue potenzielle Biomarker für klarzelliges Nierenzellkarzinom (ccRCC).

2. Die frühe diagnostische Signatur bestehend aus KMT2D und PREX2 zeigte eine hohe Genauigkeit bei der Unterscheidung von ccRCCs von gesunden Personen.

3. Die differenzialdiagnostische Signatur bestehend aus CUL9, KMT2D und PREX2 zeigte eine hervorragende Leistung bei der Unterscheidung von ccRCCs von gutartigen Nierentumoren.

4. Diese Signaturen könnten vielversprechende und nichtinvasive Biomarker für die ccRCC-Erkennung sein.

Peer-Review-Berichte

Das Nierenzellkarzinom (RCC) entsteht aus tubulären Epithelzellen der Niere und macht mehr als 90 % der bösartigen Nierentumoren aus [1]. Die Inzidenz von RCC nimmt weltweit stetig zu, wobei die Inzidenzrate in Entwicklungsländern höher und die Inzidenzrate in Industrieländern höher ist [2]. Frühes RCC ist organbegrenzt und weist eine 5-Jahres-Überlebensrate von über 90 % auf. Sobald RCC jedoch in lokale Organe eindringt oder sich über die Ferne ausbreitet, ist die Behandlung des Tumors recht komplex und die Prognose schlecht [3]. Klarzelliges RCC (ccRCC) ist der häufigste Subtyp und macht etwa 75 % der neu diagnostizierten RCC aus [1]. Daher ist die genaue Früherkennung von ccRCC für die Behandlung von RCC von großer Bedeutung. Leider gibt es bisher keine nachgewiesenen Tumorbiomarker für die Früherkennung von ccRCC.

Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel mit einem Durchmesser von 40–150 nm, die von Zellen abgesondert werden, die Moleküle wie Nukleinsäuren, Proteine, Lipide, Aminosäuren und Metaboliten enthalten. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der zellulären Kommunikation und der Regulierung der physiologischen und pathologischen Prozesse der menschlichen Körper [4]. Noch wichtiger ist, dass die Lipiddoppelschichtmembranstruktur von Exosomen resistent gegen die Wirkung exogener Proteasen und RNA-Enzyme ist, was zu stabileren Substanzen wie Messenger-RNAs (mRNAs), microRNAs (miRNAs) und funktionellen Proteinen führt [5, 6]. Von Tumoren abgeleitete Exosomen, die verschiedene Moleküle tragen, könnten eine vielversprechende nichtinvasive Methode zur Erkennung von Krebserkrankungen darstellen [7].

Kürzlich erschienene Berichte deuten darauf hin, dass zirkulierende exosomale RNAs (exRNAs) als vielversprechende Biomarker für die Krebserkennung dienen können [8,9,10]. Studien haben gezeigt, dass exosomale miRNAs in Blut und Urin Nierenzellkarzinome effektiv von gesunden Kontrollpersonen unterscheiden können, was darauf hindeutet, dass exosomale miRNAs als Biomarker zum Nachweis von RCC verwendet werden könnten [11, 12]. Aufgrund der breiten Akzeptanz der Sequenzierung kleiner RNA durch ERCC1-Gruppen und der jüngsten Forschung von Forschern wurden andere RNA-Biotypen, insbesondere lange RNAs, untersucht [13]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass extrazelluläre Vesikel lange RNAs (exLRs), hauptsächlich mRNAs, potenzielle Biomarker für Prostatakrebs (PCa) [14], Gliome [15], hepatozelluläres Karzinom (HCC) [16, 17] und duktales Adenokarzinom des Pankreas sein könnten ( PDAC) [18] usw. Obwohl einige vorläufige Studien veröffentlicht wurden, in denen versucht wurde, emRNAs zum Nachweis von ccRCC zu identifizieren, war ihre klinische Leistung aufgrund des Studiendesigns (d. h. kleine Probengröße [19], Fehlen eines echten Negativs) weitgehend begrenzt Kontrolle [19] und mangelnde Validierung in klinischen Proben [20]).

In dieser Studie untersuchten wir systematisch die Profilierung zirkulierender exosomaler mRNA (emRNA) durch RNA-Sequenzierung zwischen lokalisierten ccRCCs und gesunden Kontrollpersonen und fanden eine Reihe von ccRCC-assoziierten emRNAs. Anschließend identifizierten und validierten wir mehrere emRNAs mit diagnostischem Potenzial in einer großen Kohorte von 488 Teilnehmern. Schließlich haben wir emRNA-basierte Signaturen für die Frühdiagnose von ccRCC etabliert.

Die demografischen und klinischen Merkmale der Entdeckungs-, Test-, Schulungs- und Validierungskohorten der Teilnehmer sind in Tabelle 1 und Zusatzdatei 2 dargestellt: Tabelle S1. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Verteilung von Geschlecht und Alter zwischen lokalisierten ccRCCs und gesunden Kontrollpersonen in den Entdeckungs-, Test-, Trainings- und Validierungskohorten der Teilnehmer (Tabelle 1). Bei den Teilnehmern der ccRCC-Gruppe und der Gruppe der Patienten mit gutartigen Raumforderungen in der Validierungskohorte war die Altersverteilung zwischen ccRCCs und gutartigen Kontrollpersonen ähnlich. Die mittlere Tumorgröße zu Studienbeginn betrug in vier Kohorten lokalisierter ccRCCs alle weniger als 4 cm. Die klinischen Tumorstadien waren T1–2 in vier Kohorten lokalisierter ccRCCs. In der überwiegenden Mehrheit der ccRCC-Fälle war der pathologische Grad G1-2 (83,3 % in der Entdeckungskohorte, 93,8 % in der Testkohorte, 88,0 % in der Trainingskohorte, 96,2 % in der Validierungskohorte). Die demografischen und klinischen Merkmale der Teilnehmer mit der Gruppe gutartiger solider und zystischer Raumforderungen sind in der Zusatzdatei 2: Tabelle S1 dargestellt. In der soliden Gruppe gab es weniger männliche Teilnehmer und die Teilnehmer in der soliden Gruppe waren jünger als diejenigen in der zystischen Gruppe und der ccRCC-Gruppe. Die Tumorgrößen waren in der zystischen Gruppe größer als in der soliden Gruppe.

In der Entdeckungsphase untersuchten wir das zirkulierende emRNA-Profiling zwischen 12 lokalisierten ccRCCs (n = 12) und gesunden Kontrollpersonen (n = 22) mittels RNA-Seq. Anschließend wurden basierend auf den RNA-Sequenzierungsdaten 210 fehlregulierte emRNAs (p <0,05, fache Änderung > 2 oder <0,5, FDR <0,05, Zusatzdatei 2: Tabelle S3) identifiziert. Die Heatmap veranschaulichte die Expressionsniveaus der repräsentativen ccRCC-assoziierten emRNAs (Zusatzdatei 1: Abb. S2A). Sieben hochregulierte emRNAs, die mit ccRCC oder/und mehreren bösartigen Tumoren in Zusammenhang stehen, darunter CUL9, ATM, ARID1A, KMT2D, PBRM1, PREX2 und SETD2, wurden als Kandidaten-Biomarker für weitere Tests ausgewählt. Anschließend testeten wir die Expressionsniveaus dieser sieben Kandidaten-emRNAs durch RT-qPCR in einer zusätzlichen Kohorte lokalisierter ccRCCs (n = 16) und gesunder Kontrollpersonen (n = 20). ATM und ARID1A wurden ausgeschlossen, da sie keinen Unterschied zwischen der ccRCC-Gruppe und der gesunden Gruppe zeigten (Zusatzdatei 1: Abb. S2B). Schließlich wurden die verbleibenden 5 emRNAs (CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 und SETD2), die in ccRCCs hochreguliert wurden, zum Training und zur Validierung einbezogen (zusätzliche Datei 1: Abb. S2B).

In der Trainingsphase wurden die Expressionsniveaus von emRNAs in einer zusätzlichen Kohorte von 142 klinischen Proben, darunter lokalisierte ccRCCs (n = 92) und gesunde Kontrollpersonen (n = 50), durch RT-qPCR nachgewiesen, was ergab, dass CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 und SETD2 waren in der ccRCC-Gruppe signifikant höher als in der gesunden Gruppe, und jeder der Kandidaten-Biomarker erzielte eine gute Leistung bei der Unterscheidung lokalisierter ccRCCs von gesunden Kontrollpersonen mit entsprechenden AUCs von 0,611, 0,668, 0,639, 0,742 und 0,680. bzw. (Tabelle 2, Abb. 1A und Zusatzdatei 1: Abb. S3A). Darüber hinaus wurden KMT2D und PREX2 durch multivariate logistische Regressionsanalyse als signifikante Biomarker für die ccRCC-Diagnose identifiziert (Tabelle 2). Diese beiden emRNAs wurden dann in einer zusätzlichen Kohorte lokalisierter ccRCCs (n = 106) und gesunder Kontrollpersonen (n = 97) validiert. In der ccRCC-Gruppe wurden im Vergleich zur gesunden Gruppe hohe Expressionsniveaus von KMT2D und PREX2 beobachtet (Abb. 1B). Die diagnostische Genauigkeit von KMT2D und PREX2 hatte AUCs von 0,655 bzw. 0,776 (Tabelle 2, Zusatzdatei 1: Abb. S3B). Nach einer multivariaten logistischen Regressionsanalyse zeigten KMT2D und PREX2 immer noch statistische Signifikanz für die Unterscheidung lokalisierter ccRCCs von Kontrollen (Tabelle 2).

Validierung ccRCC-assoziierter zirkulierender emRNAs und Etablierung einer emRNA-basierten frühen Diagnosesignatur für klarzelliges Nierenzellkarzinom (ccRCC). A Streudiagramme, die die Expressionsniveaus von ccRCC-assoziierten zirkulierenden emRNAs, einschließlich CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 und SETD2, zwischen lokalisierten ccRCCs (n = 92) und gesunden Kontrollpersonen (n = 50) in der Trainingsphase zeigen. B Streudiagramme, die die Expressionsniveaus von KMT2D und PREX2 zeigen, die durch multivariate logistische Regressionsanalyse zwischen lokalisierten ccRCCs (n = 106) und gesunden Kontrollpersonen (n = 97) in der Validierungsphase als signifikante Biomarker für die ccRCC-Diagnose identifiziert wurden. C, D ROC-AUC-Auswertung zeigte die diagnostische Leistung der Signatur bestehend aus KMT2D und PREX2 zur Unterscheidung lokalisierter ccRCCs von gesunden Kontrollen in der Trainingsphase (n = 142) und der Validierungsphase (n = 203). ccRCC, klarzelliges Nierenzellkarzinom; ROC, Receiver-Operator-Charakteristik; AUC, Fläche unter der Kurve

In den Trainingskohorten (n = 142) verwendeten wir eine multivariate logistische Regressionsanalyse, um eine emRNA-basierte ccRCC-Signatur zu erstellen, die KMT2D und PREX2 umfasst. Die diagnostische Leistung der Signatur (Logit (p = ccRCC) = 1,21943 × KMT2D + 1,97072 × PREX2 + 1,30485), gemessen anhand der AUC, betrug 0,836 (p < 0,001; 95 %-KI, 0,765 bis 0,893, Abb. 1C). Die aus dem Trainingssatz identifizierten neuartigen Biomarker (KMT2D und PREX2) wurden in der Validierungskohorte der Teilnehmer (n = 203) angewendet. Anschließend wurden diese Gene auf das obige Modell angewendet und der ROC konstruiert. Die diagnostische Signatur zeigte auch eine hohe Genauigkeit bei der Unterscheidung von ccRCCs von gesunden Kontrollpersonen, mit einer Fläche unter der Receiver Operating Characteristic Curve (AUC) von 0,830 (p < 0,001; 95 %-KI, 0,771 bis 0,879, Abb. 1D). Diese Ergebnisse zeigten, dass die emRNA-Signatur als neuartige Methode zur Früherkennung von ccRCC bei gesunden Kontrollpersonen dienen könnte.

Es ist von großer Bedeutung, ein ccRCC anhand einer kleinen Nierentumordiagnose zu diagnostizieren. Daher haben wir zusätzliche Proben von Teilnehmern mit gutartigen Nierentumoren (n = 73), einschließlich solider Raumforderungen (n = 47) und zystischer Raumforderungen (n = 26), gesammelt, um die diagnostische Rolle der fünf Kandidaten-emRNAs, einschließlich CUL9 und KMT2D, zu bewerten , PBRM1, PREX2 und SETD2, bei der Unterscheidung von ccRCCs von Patienten mit gutartigen Nierentumoren. Wir haben zunächst die Expressionsniveaus der emRNA-Kandidaten zwischen ccRCCs und Patienten mit gutartigen Nierentumoren untersucht. In ccRCCs wurden im Vergleich zu denen bei Patienten mit gutartigen Nierentumoren hohe Expressionsniveaus von CUL9 und PREX2 beobachtet (Abb. 2A). Die diagnostische Leistung von CUL9, KMT2D und PREX2 hatte AUCs von 0,619, 0,585 bzw. 0,629 (Tabelle 3, Zusatzdatei 1: Abb. S3C). Nach einer multivariaten logistischen Regressionsanalyse zeigten diese drei Kandidaten immer noch statistische Signifikanz für die Unterscheidung von ccRCCs von Patienten mit gutartigen Nierentumoren mit multivariaten p-Werten < 0,0001, < 0,0001 bzw. 0,0001 (Tabelle 3). Um die Leistung der Signatur zu bewerten, die zur Unterscheidung von ccRCC von gesunden Kontrollpersonen bei der Differenzierungsdiagnose von Nierentumoren abgeleitet wurde, verwendeten wir die Signatur zur Unterscheidung von ccRCCs von Patienten mit gutartigen Nierentumoren. Die durch AUC ausgewertete diagnostische Leistung der Signatur betrug jedoch nur 0,559 (Zusatzdatei 1: Abb. S4), was darauf hinweist, dass die Signatur zum Nachweis von ccRCC aus gesunden Kontrollpersonen bei der Differenzialdiagnose von Nierenmassen nicht anwendbar war. Anschließend verwendeten wir eine logistische Regressionsanalyse, um eine emRNA-basierte diagnostische Signatur unter Verwendung von CUL9, KMT2D und PREX2 zu erstellen, logit (p = ccRCC) = 1,68689 × CUL9 − 1,16173 × KMT2D + 1,17881 × PREX2 + 0,75145. Die Signatur zeigte eine hervorragende Leistung bei der Diagnose von ccRCCs bei Patienten mit gutartigen Nierentumoren (AUC = 0,816, p < 0,001; 95 %-KI, 0,751 bis 0,870, Abb. 2B). Darüber hinaus zeigte die diagnostische Signatur auch eine hervorragende Fähigkeit, ccRCC von gutartigen festen Raumforderungen (AUC = 0,810, p < 0,001; 95 %-KI, 0,739 bis 0,869, Abb. 2C) und gutartigen zystischen Raumforderungen (AUC = 0,832, p < 0,001) zu unterscheiden ; 95 % KI, 0,757 bis 0,891, Abb. 2D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die emRNA-basierte diagnostische Signatur ein neuartiger nichtinvasiver Biomarker zur Verbesserung der ccRCC-Diagnose sein könnte.

Etablierung einer emRNA-basierten Diagnosesignatur für klarzelliges Nierenzellkarzinom (ccRCC). A Streudiagramme, die die Expressionsniveaus von Kandidaten-emRNAs, einschließlich CUL9, KMT2D, PBRM1, PREX2 und SETD2, zwischen lokalisierten ccRCCs (n = 106) und Patienten mit gutartigen Nierentumoren (n = 73) zeigen. B Die ROC-AUC-Auswertung zeigte die diagnostische Leistung der diagnostischen Signatur bestehend aus CUL9, KMT2D und PREX2 zur Unterscheidung lokalisierter ccRCCs (n = 106) von Patienten mit gutartigen Nierentumoren (n = 73). C, D ROC-AUC-Auswertung zeigte die diagnostische Leistung der Signatur bestehend aus CUL9, KMT2D und PREX2 zur Unterscheidung lokalisierter ccRCCs (n = 106) von Patienten mit gutartigen soliden Raumforderungen (n = 47) und gutartigen zystischen Raumforderungen (n = 26). . ccRCC, klarzelliges Nierenzellkarzinom; ROC, Receiver-Operator-Charakteristik; AUC, Fläche unter der Kurve

Als eine der gefährlichsten urologischen bösartigen Erkrankungen verfügt das ccRCC immer noch nicht über ideale diagnostische Instrumente oder Strategien. Eine multizentrische prospektive Beobachtungskohortenstudie mit 706 Patienten im Vereinigten Königreich verdeutlichte die Bedeutung der Früherkennung von RCC und legt nahe, dass sich die Konzentration auf RCC-bezogene Symptome auf die Verbesserung der Frühdiagnose von RCC beschränkt [21]. Der Verbesserung diagnostischer Strategien und der Identifizierung diagnostischer Biomarker sollte mehr Aufmerksamkeit gewidmet werden.

Ungefähr 60 % der RCC-Patienten werden zufällig diagnostiziert, und die meisten von ihnen werden durch bildgebende Untersuchungen diagnostiziert [21]. Ultraschall ist eine relativ kostengünstige, bequeme und sichere Untersuchung und kann 85–100 % der Tumoren > 3 cm, aber nur 67–82 % der Tumoren mit einer Größe von 2–3 cm erkennen, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise noch mehr falsche Ergebnisse gibt -negative Ergebnisse bei der Erkennung von Tumoren < 3 cm Größe mittels Ultraschall [22]. Andererseits sind Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) für die Erkennung von RCC empfindlicher und spezifischer als Ultraschall. Aufgrund der geringen Kosteneffektivität und Strahlendosis ist es jedoch unwahrscheinlich, dass CT oder MRT für das Bevölkerungsscreening empfohlen werden sollten [23]. Darüber hinaus werden bei der CT- oder MRT-Untersuchung häufig weitere Zufallsbefunde festgestellt, die zu einer Überdiagnose verschiedener unsicherer viszeraler Raumforderungen führen können. Daher sollte die Schaffung einer kostengünstigen, genauen, praktikablen und risikoarmen Screening-Methode für ccRCC in Betracht gezogen werden.

Derzeit widmen sich immer mehr Studien der Entdeckung diagnostischer Biomarker für ccRCC. Mehrere in Serum und Urin gefundene Biomarker wurden als neuartige Screening- oder Diagnoseinstrumente empfohlen, mit denen RCC von nichtrenalen urologischen Tumoren, gutartigen Nierentumoren und gesunden Kontrollpersonen unterschieden werden kann [24]. Die Forscher fanden heraus, dass AQP1 und PLIN2 im Urin bei Patienten mit ccRCC und papillärem RCC (n = 47) deutlich hochreguliert waren, was ein hohes Potenzial als Screening-Biomarker für RCC und als differenzialdiagnostisches Instrument für Nierentumoren zeigt [25]. Aufgrund der geringen Probengröße müssen Urin-AQP1 und PLIN2 jedoch weiter validiert werden. Eine andere Forschergruppe entwickelte einen Serum/Plasma-Drei-Marker-Assay bestehend aus N-Methyltransferase (NNMT), L-Plastin (LCP1) und nicht-metastatischem Zellen-1-Protein (NM23A), um die Früherkennung von RCC zu verbessern. Der Drei-Marker-Assay weist im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen und gutartigen Tumoren eine hohe Sensitivität, Spezifität und diagnostische AUC (95,6 %, 90,9 % und 0,932) für RCC auf, ist jedoch nur begrenzt in der Lage, RCC von gutartigen Nierentumoren zu unterscheiden [26]. Generell hat die Flüssigbiopsie mit Blut oder Urin noch großes Potenzial zur Verbesserung der Früherkennung und Differenzialdiagnose von RCC.

Die Eigenschaften von Exosomen machen Exosomen-bezogene Tests zu einer immer bemerkenswerteren nichtinvasiven und wirksamen Methode zur Krankheitsdiagnose und -überwachung [8, 27]. Das große Potenzial von Exosomen in der Diagnose und Behandlung wurde bei mehreren Krebsarten, wie Prostata-, Blasen- und Brustkrebs, nachgewiesen [28, 29]. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass exosomale RNAs, insbesondere miRNAs, ein großes Potenzial für die Erkennung von RCC haben könnten [30]. Die MiR-21-Spiegel waren in ccRCCs sowohl im Serum als auch in den Serum-Exosomen höher als bei gesunden Kontrollpersonen. Exosomales miR-210 im Serum konnte ccRCCs effektiv von Kontrollen unterscheiden (AUC = 0,8779) [31]. Eine andere Studie ergab, dass exosomales miR-210 und miR-1233 im Serum neue Biomarker für die Diagnose von ccRCC sein könnten [32]. Andere fanden heraus, dass hsa-mir-149-3p und hsa-mir-424-3p, die durch exosomale miRNA-Sequenzierung entdeckt wurden, in RCCs höhere Expressionsniveaus aufwiesen als in gesunden Kontrollpersonen [12]. Diese früheren Studien konzentrierten sich jedoch auf zirkulierende miRNAs, und es gibt noch keine Studien, die die mögliche Rolle zirkulierender emRNAs bei der Früherkennung von ccRCC untersuchen. In dieser Studie untersuchten wir systematisch die Profilierung zirkulierender emRNA durch RNA-Sequenzierung zwischen lokalisierten ccRCCs und gesunden Kontrollpersonen und fanden eine Reihe von ccRCC-assoziierten emRNAs. Anschließend identifizierten wir 5 ccRCC-assoziierte emRNAs mit diagnostischem Potenzial und erstellten eine emRNA-basierte Screening-Signatur mit hervorragender Fähigkeit zur ccRCC-Erkennung. Diese Signatur könnte als neuer Biomarker dienen, um ccRCC aus der Normalbevölkerung herauszufiltern.

Mit der weit verbreiteten Anwendung der Querschnittsbildgebung ist die Inzidenz von Nierentumoren, insbesondere von kleinen Nierentumoren (SRMs, Durchmesser < 4 cm), deutlich gestiegen [33]. SRMs erhöhen die Schwierigkeit der Differentialdiagnose. Es wurde berichtet, dass 20 % der Nierentumoren < 4 cm als gutartige Histologie identifiziert wurden, während der Anteil der gutartigen Histologie bei solchen ≥ 7 cm 6,3 % betrug [34]. Nierenraumforderungen können in feste Raumforderungen, zystische Raumforderungen und entzündliche Raumforderungen unterteilt werden [35]. Die Mehrheit der Patienten mit Nierentumoren sind asymptomatisch und die Hauptmorphologie der Nierentumoren ist solide und zystisch. Die in der klinischen Praxis am häufigsten vorkommende gutartige solide Nierentumorerkrankung ist das Angiomyolipom (AML) [36, 37]. Allerdings haben fast 5 % der AML, sogenannte lipidarme AML, zu wenig Fett, um mittels CT oder MRT diagnostiziert zu werden [38, 39]. Daher sind lipidarme AMLs schwer von RCC zu unterscheiden, und einige dieser Tumoren werden nach einer Operation diagnostiziert [40]. Das renale Onkozytom (RO) ist eine gutartige epitheliale Neoplasie, die normalerweise große Zellen mit körnigem eosinophilem Zytoplasma enthält [41]. Allerdings kommt es in 2–20 % der RO-Fälle zu einer perinephrischen Fettinvasion, und etwa 5,4 % der RO-Fälle weisen eine Gefäßinvasion auf [42]. Diese Merkmale werden allgemein als ein Merkmal der Malignität beim RCC angesehen, was die Differenzialdiagnose erschweren kann. Andererseits sind die meisten zystischen Raumforderungen in der Niere nicht-neoplastische Zysten, aber viele Nierentumoren enthalten Zysten als untergeordnete oder dominante Komponente; Daher ist die Differenzialdiagnose von gutartigen und bösartigen renalen zystischen Raumforderungen erforderlich [43]. Um ccRCC zu identifizieren, ist es wichtig, maligne renale Raumforderungen von gutartigen soliden und zystischen Raumforderungen zu unterscheiden. Die Entwicklung einer nichtinvasiven Methode zur Differentialdiagnose bleibt von großem potenziellem Wert für die klinische Praxis.

In unserer Studie haben wir außerdem das Serum von 106 ccRCCs und 73 Patienten mit gutartigen Nierentumoren gesammelt und dann eine ccRCC-Diagnosesignatur mit drei Kandidatengenen erstellt, die durch eine multivariate schrittweise logistische Regressionsanalyse herausgesucht wurden. Diese Signatur zeigte eine hervorragende Fähigkeit, ccRCCs von Patienten mit gutartigen Nierentumoren zu unterscheiden, egal ob solide oder zystisch. Daher könnten die diagnostischen Signaturen diejenigen unterscheiden, bei denen die Natur der Nierentumoren unsicher ist, wie z. B. zystisches Nierenkarzinom, fettarmes Angiomyolipom und renales Onkozytom, insbesondere wenn die Raumforderung klein war und das Wesen des Tumors nicht durch Bildgebung bestimmt werden konnte.

Unsere Studie hatte auch einige Einschränkungen. Erstens war die Stichprobengröße als monozentrische retrospektive Studie begrenzt. Die Ergebnisse, insbesondere die Leistungsfähigkeit der emRNA-Signatur zur Diagnose von Nierentumoren, müssen in einer weiteren multizentrischen prospektiven Großstudie validiert werden. Zweitens konnte unsere Studie aufgrund unzureichender Proben für andere Arten von zystischen Nierentumoren keine Differenzialdiagnose für Nierentumoren mit Bosniak-Grad durchführen. Schließlich konzentrierte sich diese Studie hauptsächlich auf die Erforschung von Biomarkern im peripheren Blut, die für die Frühdiagnose von Tumoren geeignet sind, umfasste jedoch nicht die Analyse klinischer Faktoren wie Rauchen, Fettleibigkeit, Bluthochdruck und anderer Variablen, die mit klinischen Merkmalen kombiniert werden könnten in der Folgestudie ein umfassendes diagnostisches und prognostisches Modell von Tumoren etablieren. Zell- und Tierversuche wurden ebenfalls nicht durchgeführt, da es an gewisser theoretischer Unterstützung mangelte, und die Rolle und der Sekretionsmechanismus von exosomaler mRNA und RCC werden anschließend weiter erforscht.

Wir berichteten erstmals über eine systematische ccRCC-Biomarker-Untersuchung unter Verwendung von zirkulierendem emRNA-Profiling. Wir haben neuartige emRNA-basierte Signaturen für die Früherkennung von ccRCC und die Differentialdiagnose unsicherer Nierentumoren etabliert und validiert. Diese Signaturen könnten vielversprechende und nichtinvasive Biomarker für die Erkennung von ccRCC sein und so die Prognose von ccRCC-Patienten verbessern.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission für klinische Forschung des Shanghai Changhai Hospital (Shanghai, China) genehmigt (Nr. CHEC2020-112). Alle klinischen Proben wurden vom Shanghai Changhai Hospital bezogen. Vor der Probenahme wurde von den Teilnehmern eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. In dieser Studie wurden 488 Teilnehmer, darunter lokalisierte ccRCCs (n = 226), Patienten mit gutartigen Nierentumoren (n = 73) und gesunde Kontrollpersonen (n = 189), nacheinander von August 2017 bis Juli 2020 rekrutiert durch chirurgische Pathologie bestätigt und von zwei unabhängigen Pathologen untersucht. Das Tumorstadium und der pathologische Grad wurden gemäß den 8. TNM-Kriterien geschätzt, die 2017 vom American Joint Committee on Cancer (AJCC) vorgeschlagen wurden. Die Einschlusskriterien für Patienten mit Nierentumoren waren wie folgt: (1) Alter 20–80 Jahre; (2) CT-Scans vor der Operation; (3) eine eindeutige Diagnose anhand der Pathologie; (4) ccRCC-Teilnehmer mit klinischen Tumorstadien I und II (lokalisiertes Nierenkarzinom); (5) wurde operiert und vor der Probenahme keiner Krebsbehandlung unterzogen; (6) keine Vorgeschichte anderer Krebsarten; und (7) unterzeichnete Einverständniserklärung. Die Einschlusskriterien für gesunde Kontrollpersonen waren wie folgt: (1) Alter zwischen 20 und 80 Jahren, (2) wurde einer Gesundheitsuntersuchung unterzogen und als asymptomatisch und gesund angesehen, (3) die Ultraschalluntersuchung zeigte keine Masse und (4) unterzeichnete Einverständniserklärung . Die Ausschlusskriterien waren wie folgt: (1) zuvor diagnostizierte Nierentumoren, (2) erhaltene Ablationstherapie und (3) andere bösartige Tumoren.

Diese Studie bestand aus vier Phasen: Entdeckung, Test, Schulung und Validierung. Die Teilnehmer der Entdeckungs-, Schulungs- und Validierungsphasen wurden nacheinander eingeschrieben und zufällig in diese Gruppen eingeteilt. Die Teilnehmer der Testphase wurden zufällig aus der Trainingsphase ausgewählt. Eine Übersicht über den Arbeitsablauf ist in Abb. 3 zusammengefasst. Die klinischen Merkmale der Teilnehmer sind in Tabelle 1 zusammengefasst. In der Entdeckungsphase untersuchten wir das zirkulierende emRNA-Profiling in ccRCCs (n = 12) und gesunden Kontrollpersonen (n = 22). RNA-seq. Dysregulierte (p < 0,05, fache Änderung > 2 oder < 0,5, FDR < 0,05) emRNAs in ccRCC wurden identifiziert. Die sieben am stärksten hochregulierten emRNAs, die auch mit ccRCC oder/und mehreren bösartigen Tumoren in Zusammenhang standen, wurden als Kandidaten-Biomarker für weiteres Training und Validierung ausgewählt (siehe Einzelheiten zu „Die Auswahlstrategie der Kandidaten-Biomarker“ in der Zusatzdatei 3: Hintergrundinformationen). In der Testphase wurden die Expressionsniveaus der Kandidaten-emRNAs in lokalisierten ccRCCs (n = 16) und gesunden Kontrollpersonen (n = 20) mittels RT-qPCR bewertet. In der Trainingsphase wurden die Expressionsniveaus der in der Testphase identifizierten signifikanten emRNAs in einer anderen Kohorte lokalisierter ccRCCs (n = 92) und gesunden Kontrollpersonen (n = 50) mittels RT-qPCR bewertet. Eine schrittweise logistische Regressionsanalyse wurde verwendet, um die signifikanten Prädiktoren zu identifizieren und eine emRNA-basierte ccRCC-Signatur zu erstellen, um ccRCCs von gesunden Kontrollpersonen zu unterscheiden. Die Signatur wurde dann in einer zusätzlichen Kohorte lokalisierter ccRCCs (n = 106) und gesunder Kontrollpersonen (n = 97) validiert. Darüber hinaus haben wir die diagnostische Leistung der Kandidaten-emRNAs bei der Unterscheidung von ccRCCs von Patienten mit gutartigen Nierentumoren bewertet. In dieser Phase wurden Patienten mit gutartigen Nierentumoren (n = 73), einschließlich solider Nierentumoren (n = 47) und zystischer Nierentumoren (n = 26), eingeschlossen (die detaillierten klinischen Merkmale sind in der Zusatzdatei 2: Tabelle S1 zusammengefasst). ). Ebenso haben wir eine schrittweise logistische Regressionsanalyse angewendet, um die signifikanten Prädiktoren zu identifizieren und eine emRNA-basierte Signatur zu erstellen, um ccRCCs von Patienten mit gutartigen Nierentumoren, einschließlich solider und zystischer Raumforderungen, zu unterscheiden.

Arbeitsablauf des Studiendesigns. ccRCC, klarzelliges Nierenzellkarzinom; RNA-seq, RNA-Sequenzierung; emRNA, exosomale Messenger-RNA; PCR, Polymerase-Kettenreaktion

Die Patienten mit Nierentumoren unterzeichneten am ersten Tag der Aufnahme eine Einverständniserklärung, und am zweiten Morgen wurde ihr peripheres Nüchternblut entnommen. Gesunde Kontrollpersonen unterzeichneten am Tag der Gesundheitsuntersuchung eine Einverständniserklärung und ihr peripheres Nüchternblut wurde vor der körperlichen Untersuchung entnommen. Die Proben wurden in einem Kühlschrank bei 4 °C gelagert und mit Eis ins Labor transportiert. Die Blutproben wurden bei Raumtemperatur mindestens 30 Minuten und höchstens 2 Stunden lang gerinnen gelassen. Alle Proben wurden dann 15 Minuten lang bei 1600 × g zentrifugiert, um das Serum abzutrennen, und das Serum (Überstand) wurde in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und nummeriert. Die Serumproben wurden sofort bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 °C gelagert.

Ein exoEasy Maxi Kit (Nr. 76064, Qiagen, Düsseldorf, Nordrhein-Westfalen, Deutschland) wurde zur Reinigung von Exosomen aus Serum gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Zuerst wurde das Serum durch eine 0,22-μm-Filtermembran filtriert, ein gleiches Volumen XBP-Pufferbündel hinzugefügt und dann vorsichtig fünfmal umgedreht und gemischt. Nach dem Mischen wurde die obige Probenmischung auf die Adsorptionssäule gegeben und 1 Minute lang bei Raumtemperatur mit 500 × g zentrifugiert. Die Durchflusslösung wurde aus der Adsorptionssäule verworfen. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Dann wurden etwa 5 ml XWP-Puffer zur Reinigung in die Adsorptionssäule gegeben und 5 Minuten lang bei 5000 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Adsorptionssäule wurde entsorgt und die Serum-Exosomen wurden auf der Membran der Adsorptionssäule immobilisiert. Danach wurde die Adsorptionssäule in ein neues Sammelröhrchen gegeben und 400 μl XE-Puffer zur Elution in die Säule gegeben, dann 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert und 5 Minuten bei 500 × g zentrifugiert. Abschließend wurde das Eluat im Sammelröhrchen zurück in die Adsorptionssäule gegeben und 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Das Eluat wurde 5 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert und in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Exosomen könnten für weitere Forschungen verwendet oder bei –80 °C gelagert werden.

Die gereinigte Exosomenprobe wurde 100-fach mit PBS (SH30256.01, HyClone, Logan, UT, USA) verdünnt und für die Elektronenmikroskopie (JEM-1400, JEOL, Akishima, Tokio, Japan) verwendet. Insgesamt 20 μl der verdünnten Probe wurden pipettiert, in die Mitte eines Kupfernetzes getropft und 20 Minuten stehen gelassen. Anschließend wurde die Flüssigkeit mit Filterpapier abgetupft, um die Negativfärbung vorzubereiten. Eine Negativfärbung wurde mit 1 % Phosphorwolframsäure für etwa 10 s durchgeführt und Filterpapier wurde zum Abtupfen der überschüssigen Flüssigkeit verwendet. Dann wurden vorsichtig 20 μl ddH2O in die Mitte des Kupfernetzes gegeben und nach 20 s wurde die restliche Flüssigkeit mit Filterpapier vom Netz abgesaugt. Das fertige Kupfernetz war für die Exosomenidentifizierung bereit. TEM zeigte das Vorhandensein von Exosomen als abgerundete, bikonkavscheibenförmige, vesikelartige Strukturen (Zusatzdatei 1: Abb. S1A).

Die extrahierten Exosomen wurden 1:200 verdünnt (gefiltertes PBS). Das vom Nano Sight 300 (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK) erkannte Modul wurde dreimal mit ddH2O gewaschen und anschließend wurde das Modul sieben bis acht Mal mit Spritzenluft gespült, um so viel Restflüssigkeit wie möglich zu entfernen. Ein Milliliter der gut gemischten und verdünnten Exosomenprobe wurde mit einer Spritze in das Modul gesaugt und die Luftblasen in der Detektionskammer des Moduls wurden ausgestoßen. Die Anzahl der Wiederholungen der Bildaufnahme wurde auf 3 und die Dauer jeder Aufnahme auf 60 s festgelegt. NTA zeigte, dass die Spitzen der zirkulierenden Exosomen von RCC, Patienten mit gutartigen Raumforderungen und gesunden Kontrollpersonen 74 nm, 77 nm bzw. 79 nm lagen und im Bereich von 50 bis 200 nm lagen (Zusatzdatei 1: Abb. S1B).

Den extrahierten Exosomen wurden insgesamt 50 μl RIPA-Lysepuffer (P0013C, Beyotime, Shanghai, China) und 0, 5 μl Proteaseinhibitor zugesetzt. Die Mischung wurde 20 Minuten lang bei 4 ° C und 15.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und die Konzentration mit einem BCA-Kit (5.000.112, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) gemessen. Als nächstes wurde den Proben 5 × Ladepuffer (P0015, Beyotime, Shanghai, China) zugesetzt. Diese Proben wurden 15 Minuten lang in einem 99 °C heißen Metallbad (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert. Mit einem PAGE Gel Fast Prepared Kit (PG112, EpiZyme, Shanghai, China) wurden 10 % Trennkleber und 5 % konzentrierter Kleber gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Dann wurden 30 μg Exosomenproteinproben in jede Vertiefung gegeben und 5 μl Proteinmarker (P0077, Beyotime, Shanghai, China) wurden in die leere Vertiefung gegeben. Das Gerät (165–8029, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) wurde auf 120 V eingestellt und die Elektrophorese wurde 2 Stunden lang durchgeführt. Nachdem die Elektrophorese abgeschlossen war, wurde das Gel entfernt, mit einer PVDF-Membran (IPFL00010, Millipore, Burlington, MA, USA) gestapelt, in einen Transfertank gegeben und mit Transferpuffer gefüllt. Das Gerät wurde für 2 Stunden auf 300 mA eingestellt. Nachdem der Transfer abgeschlossen war, wurden die Membranen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5 % BSA blockiert und die Membranen an geeigneten Stellen geschnitten. Dann Antikörper gegen CD9 (1:1000; AP1482D, ABGENT, Suzhou, Jiangsu, China), CD63 (1:500; AP5333B, ABGENT, Suzhou, Jiangsu, China), CD81 (1:4000; AM8557B, ABGENT, Suzhou, Jiangsu, China), TSG101 (1:2000; AM8662b, ABGENT, Suzhou, Jiangsu, China) und β-Actin (1:5000; A5441, Sigma, St. Louis, MO, USA) wurden zugegeben und bei 4° inkubiert C über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Membranen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur aufbewahrt und der primäre Antikörper entfernt. Die Membranen wurden 6 Mal jeweils 5 Minuten lang mit TBST gewaschen. Dann wurden sekundäre Antikörper hinzugefügt, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und sechsmal mit TBST jeweils 5 Minuten lang gewaschen. Clarity Max Western ECL Substrate (P0018 FS, Beyotime, Shanghai, China) wurde hinzugefügt. Die Blots wurden mit einem Bildgebungsgerät (e-Blot, Shanghai, China) abgebildet. WB zeigte, dass exosomale Biomarker, einschließlich CD9, CD63, CD81 und TSG101, in isolierten Exosomen nachweisbar waren (Zusatzdatei 1: Abb. S1C).

Zirkulierende exosomale RNA wurde mit einem exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (217.084, Qiagen, Düsseldorf, Nordrhein-Westfalen, Deutschland) gereinigt. Bei der Gesamt-RNA-Sequenzierung wurden 0,25–50 ng RNA als Input verwendet. Die gDNA-Entfernung erfolgte durch Zugabe von HL-dsDNase (70.800–202, ArcticZymes, Tromsø, Norwegen) und Reaktionspuffer (66.001, ArcticZymes, Tromsø, Norwegen). Bibliotheken für die Gesamt-RNA-Sequenzierung wurden mit dem SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2-Pico Input Mammalian (634.413, Clontech, Mountain View, CA, USA) erstellt. Im Vergleich zum Herstellerprotokoll wurde der Fragmentierungsschritt auf 2 Minuten bei 94 °C eingestellt; Danach wurde die Option gewählt, von stark degradierter RNA auszugehen. Die Bibliotheksvorbereitung umfasste auch die cDNA-Synthese, 5 Zyklen der Indexierungs-PCR, die Depletion der ribosomalen cDNA und 9–16 Zyklen der Anreicherungs-PCR. Die Größe jeder Bibliothek wurde mit einem Agilent High Sensitivity DNA Kit (5067–4626, Agilent, Santa Clara, CA, USA) und die Konzentration mit einem Library Quantification Kit (638.324, Clontech, Mountain View, CA, USA) gemessen. Alternativ können Bibliotheken mit einem Qubit dsDNA HS-Kit (Q32854, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) quantifiziert werden. Die Bibliotheken wurden zu einem äquimolaren Pool zusammengefasst, dessen Größe und Konzentration gemessen wurde, und die Bibliotheken wurden mithilfe der HiSeq 2500-Plattform (Illumina, San Diego, CA, USA) sequenziert. Um die Qualität sicherzustellen, waren 10 GB Rohdaten pro Bibliothek erforderlich.

Die Sequenzierungsdaten wurden von FastQC einer Qualitätskontrolle unterzogen und von Trimmomatic mit den folgenden Parametern getrimmt: Mindestlänge 30, Schiebefenster 4 und erforderliche Qualität 15. Anschließend wurden die sauberen Daten von STAR auf das menschliche Referenzgenom (GRCh38.p13) abgebildet mit der Gen-Annotationsdatenbank Ensembl Release-95. Schließlich verwendeten wir htseq zur Expressionsquantifizierung und das R-Paket Deseq2, um die unterschiedlich exprimierten Gene zwischen verschiedenen Gruppen zu identifizieren. Um die Falsch-Positiv-Rate fehlregulierter Gene zu reduzieren, haben wir mehrere Benjamini-Hochberg-Tests durchgeführt, um einen angepassten p-Wert zu erhalten.

Die Validierung der PCR-Produkte erfolgte mittels DNA-Gelelektrophorese. Zunächst wurden 60 ml TAE und 1 g feste Agarose gemischt und erhitzt, bis sie vollständig transparent waren. Im warmen Zustand wurden 6 µl Nukleinsäure-Färbemittel hinzugefügt, gut geschüttelt und in das Leimherstellungsgestell gegossen. Die Kammzähne wurden eingesetzt, bis sie vollständig verfestigt waren, und dann wurden die Kammzähne entfernt. Das Agarosegel wurde in den Elektrophoresetank gegeben, 1 × TAE-Lösung wurde hinzugefügt, bis der Flüssigkeitsspiegel über dem Gel lag, und die Luftblasen in der oberen Probenvertiefung wurden entfernt. Die Proben wurden geladen. Die Elektrophoresebedingungen wurden typischerweise 30 Minuten lang auf 120 V eingestellt. Nach dem Lauf wurde ein Bild des Gels erhalten.

Zirkulierende exosomale RNA wurde mit einem exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (217.084, Qiagen, Düsseldorf, Nordrhein-Westfalen, Deutschland) extrahiert und gereinigt. RNA wurde gemäß den Anweisungen des PrimeScript™ RT-Reagenzienkits (RR047A, Takara, Kyoto, Japan) revers in cDNA transkribiert. Der Vorgang sollte auf Eis durchgeführt werden und der Mastermix sollte in einer Menge zubereitet werden, die doppelt so groß ist wie die Anzahl der Reaktionen. Dann sollten 10 µl in jedes Reaktionsgefäß gegeben werden. Die Reaktionsbedingungen für die reverse Transkription waren wie folgt: 37 °C für 60 Minuten, 85 °C für 5 Sekunden und Abkühlung auf Eis vor der Verwendung. Die synthetisierte cDNA könnte sofort für nachfolgende qPCRs verwendet oder vorübergehend bei –20 °C gelagert werden.

Die Primer und Sonden sind in der Zusatzdatei 2: Tabelle S2 aufgeführt. Es wurde ein ABI 7500 Fluoreszenz-PCR-Gerät (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) verwendet. Unter Verwendung von 20 μl des qPCR-Systems, insbesondere 10 μl 2 × qPCR Master Mix und 2 μl cDNA-Lösung, betrug die Arbeitskonzentration der Upstream- und Downstream-Primer 10 μM, die Sonden wurden in einer Konzentration von 5 μM verwendet und die Die Reaktion wurde mit RNase-freiem Wasser auf 20 μl gebracht. Das qPCR-Verfahren wurde wie folgt eingestellt: 37 °C für 5 Minuten, 95 °C für 10 Minuten und 40 Zyklen von 95 °C für 15 Sekunden und Verlängerung bei 59 °C für 1 Minute.

Wir haben die Standardkurven-Quantifizierungsmethode für die emRNA-Quantifizierung angewendet. Diese Methode ähnelt früheren Ansätzen für andere RNA-Typen [44]. Kurz gesagt, wir haben die amplifizierten Fragmente jedes Zielgens synthetisiert. Während der umgekehrten Transkription dieser Gene haben wir mithilfe quantitativer Echtzeit-PCR eine Standardkurve erstellt, indem wir synthetisierte Transkripte bei unterschiedlichen Konzentrationsgradienten der Kopienzahl getestet haben. Auf diese Weise könnten wir die Kopienzahlen von Zielgenen relativ zu einer Standardprobe berechnen. Konkret wurde eine Anfangsmenge von 400 µl Serum definiert, um RNA aus Exosomen zu extrahieren. Anschließend wurde die extrahierte RNA in RNase-freiem Wasser gelöst. Anschließend wurden 20 µl emRNA für die reverse Transkription verarbeitet, um 60 µl cDNA zu ergeben. Dann fügten wir 2 µl cDNA zu 20 µl des Fluoreszenz-PCR-Systems hinzu, wobei drei Proben entnommen wurden, um den mittleren CT-Wert zu erhalten. Gleichzeitig synthetisierten wir die Ziel-RNA-Transkripte mit den Kopienzahlen 103, 104, 105, 106 und 107. Diese synthetisierten mRNAs wurden nach dem gleichen Verfahren wie die oben genannten Transkripte verarbeitet (20 µl emRNA zu 60 µl cDNA und 2 µl cDNA auf 20 µl PCR-System). Diese synthetisierten mRNAs ergaben eine Standardkurve, und wir konnten die Kopienzahl der Ziel-emRNA berechnen, indem wir den CT-Wert mit der Standardkurve abgleichten.

Die Basisanalyse der klinischen Merkmale der in diese Studie aufgenommenen Bevölkerung wurde von SPSS 21.0 (IBM Corporation, Armonk, New York, USA) durchgeführt. Die Messdaten wurden auf Normalität und Varianzhomogenität getestet, und die unabhängigen Stichproben, die der Normalverteilung entsprachen, wurden im Gruppendesign mit dem t-Test (der t'-Test wurde für Varianzinhomogenität verwendet) und dem Mann-Whitney-U-Test getestet werden verwendet, wenn sie nicht der Normalverteilung entsprechen; Gepaarte Daten wurden auf Normalität der Mittelwertdifferenz getestet, wobei der gepaarte t-Test für Normalverteilung und der Wilcoxon-Signed-Rang-Test für Nichtnormalität verwendet wurden. Für die Zähldaten wurde der Chi-Quadrat-Test oder der exakte Wahrscheinlichkeitstest nach Fisher verwendet.

Experimentelle Ergebnisse wie eine vergleichende Analyse der Genexpression, eine Einweganalyse zur grafischen Darstellung und die Berechnung des p-Werts wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Der Z-Score (z = (x − μ)/σ; μ = Average(); σ = stdevp()) wurde bei der Datenvorverarbeitung angewendet, um die Daten zu normalisieren. Die Software MedCalc 18.0 (MedCalc Software, Ostende, Belgien) wurde verwendet, um ein klinisches Diagnosemodell durch logistische Regression zu erstellen und die Fläche unter der Kurve (AUC), Sensitivität und Spezifität zu berechnen. Die Unterschiede wurden bei p < 0,05 als statistisch signifikant angesehen. Die Werte der Fläche unter der ROC-Kurve lagen im Bereich von 0,5 bis 1, mit einem niedrigen Diagnosewert zwischen 0,5 und 0,7, einem mittleren Diagnosewert zwischen 0,7 und 0,9 und einem hohen Diagnosewert über 0,9.

Die während der aktuellen Studie analysierten klinischen Datensätze sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten, und die exosomalen RNA-Sequenzierungsdaten sind auf begründete Anfrage beim CNGB Sequence Archive (CNSA: https://db.cngb.org/cnsa) verfügbar /) von CNGBdb mit der Zugangsnummer CNP0002099.

Angiomyolipom

Fläche unter der Kurve

Klarzelliges Nierenzellkarzinom

Computertomographie

Exosomale mRNA

Exosomale RNAs

Magnetresonanztomographie

Nanopartikel-Tracking-Analyse

Polymerase Kettenreaktion

Charakteristik des Empfängerbetreibers

Kleine Nierentumoren

Transmissionselektronenmikroskopie

westlicher Fleck

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Unzutreffend.

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81902616 an FW), des Shuguang-Programms der Shanghai Education Development Foundation und der Shanghai Municipal Education Commission (16SG33 an HY) sowie eines Wissenschafts- und Technologieunterstützungsprojekts im Bereich unterstützt Biomedizinischer Aktionsplan für Wissenschaft und Technologie in Shanghai (19441909200, FW).

Xing He, Feng Tian, Fei Guo, Fangxing Zhang und Huiyong Zhang trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.

Abteilung für Urologie, Changhai-Krankenhaus, Naval Medical University (Zweite Militärmedizinische Universität), 168 Changhai Road, Shanghai, 200433, China

Xing He, Fei Guo, Jin Ji, Lin Zhao, Jingyi He, Yutian Xiao, Bo Yang und Huamao Ye

Abteilung für Urologie, Achtes Volkskrankenhaus von Shanghai, 8 Caobao Road, Shanghai, 200235, China

Feng Tian und Feng Zhang

Zentrum für genomische und personalisierte Medizin, Guangxi-Schlüssellabor für genomische und personalisierte Medizin, Guangxi Collaborative Innovation Center für genomische und personalisierte Medizin, Guangxi Medical University, 22 Shuangyong Road, Nanning, 530021, Guangxi, China

Fangxing Zhang, Huiyong Zhang, Longman Li, Chunmeng Wei, Caihong Huang, Yexin Li und Fubo Wang

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Konzeption und Design: XH, FW, HY und BY; Durchführung der Experimente: XH, FG und FZ2 (Feng Zhang); klinische Datenerfassung: FT, HZ, JJ und FZ; Sammlung klinischer Proben und Probenverarbeitung: JH, LZ und JJ; Analyse und Interpretation von Daten: FW, FT, FG, FZ1 (Fangxing Zhang), HZ, YX, LL, CW und CH; Verfassen des Manuskripts: XH, FZ1 (Fangxing Zhang) und YL; überprüfte und redigierte das Manuskript: FW, HY, BY und FT; Studienbetreuung: FW, HY und BY. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Bo Yang, Huamao Ye oder Fubo Wang.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission für klinische Forschung des Shanghai Changhai Hospital genehmigt (Nr. CHEC2020-112). Von den Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Einwilligung zur Veröffentlichung

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Abb. S1. Qualitätskontrolle der Exosomenisolierung und -verifizierung. Abb.S2. Screening und Tests zirkulierender exosomaler RNA. Abb. S3. Die Leistung von Kandidaten-emRNAs für das Screening von Patienten mit lokalisiertem klarzelligem Nierenzellkarzinom (ccRCC) von gesunden Kontrollpersonen und die Unterscheidung von ccRCCs von Patienten mit gutartigen Nierentumoren. Abb. S4. AUC der Signatur wurde abgeleitet, um ccRCC von gesunden Kontrollen für ccRCC im Vergleich zu gutartigen Nierentumoren zu unterscheiden (AUC = 0,559).

Tabelle S1. Demografische und klinische Merkmale der Teilnehmer mit gutartigen soliden und zystischen Raumforderungen. Tabelle S2. Liste der Primer und Sonden. Tabelle S3. Liste der zirkulierenden exosomaldysregulierten Transkripte zwischen Patienten mit klarzelligem Nierenzellkarzinom (ccRCC) und gesunden Kontrollpersonen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

He, X., Tian, F., Guo, F. et al. Zirkulierende exosomale mRNA-Signaturen für die Frühdiagnose von klarzelligem Nierenzellkarzinom. BMC Med 20, 270 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02467-1

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Eingegangen: 23. März 2022

Angenommen: 04. Juli 2022

Veröffentlicht: 25. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02467-1

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